Alex O'Loughlin est né à Canberra mais a grandi à Sydney. Son père est professeur de physique et sa mère est infirmière. Ils se séparent lorsqu'il a deux ans. Dès l'âge de 10 ans, il fait des allers-retours entre les deux villes. En 2002, Alex O'Loughlin sort diplômé de l'Institut national d'art dramatique de Sydney et commence sa carrière au théâtre, en jouant dans des pièces de Tchekhov et Tolstoï. Il commence sa carrière au cinéma en 2004, en jouant le rôle de Jack Flange dans Oyster Farmer. L'année suivante, il tient le rôle de Michael Carter dans le film Feed dont il est également coproducteur et scénariste. Cette même année, sort le film Man-Thing dans lequel Alex O'Loughlin y interprète le rôle du député Eric Fraser. En 2007, il tient le rôle de Marcus Bohem dans le film The Invisible et celui de Marshall dans August Rush. Il joue dans la mini-série australienne Mary Bryant (Will Bryant), dans la série The Shield (détective Kevin Hiatt) et tient le rôle principal de la série Moonlight, qui n'aura duré que 16 épisodes. En 2009, il joue dans la série médicale Three Rivers, qui ne dura que 13 épisodes. Il est à l'affiche des films Whiteout aux côtés de Kate Beckinsale en 2009 et Le Plan B aux côtés de Jennifer Lopez en 2010. Depuis 2010, il incarne pour la télévision le commandant Steve McGarrett dans le remake de la série Hawaï police d'État, rebaptisée Hawaii 5-0. Il s'est présenté pour le rôle de James Bond2 mais c'est Daniel Craig qui a été retenu.